PEMERIKSAAN BAKTERIOLOGI PADA AIR (METODE MPN / MOST PROBABLE NUMBER)
PEMERIKSAAN BAKTERIOLOGI PADA AIR
PENDAHULUAN
Kualitas air yang digunakan masyarakat harus memenuhi syarat kesehatan agar dapat terhindar dari bebagai penyakit maupun gangguan kesehatan yang dapat disebabkan oleh air. Untuk mengetahui kualitas air tersebut, perlu dilakukan pemeriksaan laboratorium yang mencakup antara lain pemeriksaan bakteriologi air, meliputi Most Probable Number (MPN) dan Angka Kuman. Pemeriksaan MPN dilakukan untuk pemeriksaan kualitas air minum, air bersih, air badan air, air pemandian umum, air kolam renang dan pemeriksaan Angka Kuman dilakukan untuk pemeriksaan kualitas air kolam renang.
I. PEMERIKSAAN MPN (MOST PROBABLE NUMBER)
A.
Bahan pemeriksaan :
Air minum, air bersih, air badan air, air pemandian umum, air kolam renang
B. Persiapan Wadah
- Untuk sampel
berasal dari air keran : siapkan wadah botol berukuran 250 ml, diisi
dengan 5 tetes Natrium thiosulfat 10%, kemudian botol ditutup.
- Untuk sampel
air sumur : tanpa pemberian Na. Thiosulfat, pada bagian dasar botol diberi
pemberat yang diikat dengan kawat. Pada leher botol diikatkan tali dengan
panjang 20 meter.
- Untuk sampel
air dari sumber air yang terbuka : sungai, danau dll. Sediakan wadah botol
berukuran 250 ml tanpa pemberian Na. Thiosulfat.
- Sebelum
disterilisasi, semua botol (beserta tali dan pemberatnya) dibungkus dengan
kertas coklat atau kertas timah, dan diikat dengan benang.
- Sterilisasi dalam otoklaf selama 30 menit pada 120oC dengan tekanan 1 atm.
C. Alat, Media dan Reagensia
Alat
yang diperlukan :
- Oven 10.
Pembakar
- Otoklaf 11.
Tabung reaksi 16 x 160 mm berisi
- Inkubator tabung Durham terbalik
- Water-bath 12. Rak
tabung
- pH meter 13.
Ose
- Timbangan 14.
Erlenmeyer
- Water deionizer 15. Gelas
kimia
- Botol dilusi 16.
Termometer
- Pipet (1 dan 10 ml)
Media dan Reagensia yang diperlukan :
- Na. Thiosulfat
10% 3.
Lactosa Broth (LB)
- Alkohol 70% 4. Brilliant Green Lactosa Bile Broth (BGLB)
D. Pengambilan, Penanganan dan Pengiriman Spesimen
Pengambilan spesimen air harus dilakukan secara aseptic guna memastikan tidak terdapatnya organisme yang mengkontaminasi. Sampel air dapat berasal dari : air keran, air sumur, sumber air yang terbuka seperti air danau, dan sungai
Cara Pengambilan spesimen :
1.
Air keran
a. Bersihkan keran dari setiap benda yang
menempel yang mungkin dapat mengganggu dengan kain bersih, bersihkan mulut
keran dari kotoran atau debu
b. Putar sampai keran terbuka, sehingga air
mengalir secara maksimal dan biarkan selama 1-2 menit
c. Mulut keran disterilkan dengan cara membaka
dengan lidi kapas yang dicelupkan dalam alcohol 70% atau dengan pembakar
spiritus.
d. Buka tali pengikat dan kertas pembungkus
e. Buka tutup botol dengan tangan kiri, botol
dipegang dengan tangan kanan. Untuk mencegah masuknya debu yang mungkin
mengandung mikroorganisme, penutup dipegang dengan muka menghadap ke bawah.
f. Sambil memegang penutup, air keran ditampung
hingga ¾ bagian botol. Disisi hanya ¾ bagian botol (dengan menyisakan udara di
atasnya) dengan maksud agar air dapat dikocok sebelum dianalisis.
g. Tutup botol dengan hati-hati.
h. Kemudian bagian tutupnya dibungkus dengan
kertas steril tadi
i. Sekeliling leher botol diikat dengan tali, kemudian botol diberi label, dan catat suhu air terrsebut.
Cara Penanganan dan Pengiriman Spesimen
Pengiriman spesimen dilaksanakan
secepatnya dalam waktu kurang dari 24 jam. Sebelum dikirim, sampel air disimpan
dalam refrigerator. Bila perjalanan diperkirakan akan memakan waktu lebih dari
3 jam, spesimen harus dikirim daam suasana dingin, pada suhu 4-10oC.
Sampel air yang akan dikirim harus dikemas terlebih dahulu. Bila dipak dalam kotak kayu yang telah diberi
tanda : ATAS dan BAWAH, kemudian kotak kayu diberi penyangga (kayu) untuk
menjaga agar botol tetap menghadap ke atas. Dapat juga digunakan wadah dari
metal dengan ukuran yang sesuai dengan ukuran botol tersebut untuk menghindari
tumpah atau pecahnya botol sampel tersebut. Bungkus wadah tersebut dan
cantumkan alamat yang dituju dengan jelas.
Pengiriman spesimen dilakukan dengan memperhatikan sungguh-sungguh syarat pengiriman spesimen. Spesimen dikirim dengan disertai surat pengantar.
E. Prosedur Pemeriksaan
Pemeriksaan harus sudah dikerjakan
dalam waktu kurang dari 24 jam sejak saat pengambilan.
- Siapkan
semua peralatan kerja
- Bersihkan
semua tempat kerja dengan desinfektan
- Buka
kertas pembungkus botol sampel
- Dengan
posisi tertutup, kocok botol minimal 25 kali putaran dengan spasi gerakan
kira-kira 0,3 meter selama 7 detik, atau dikocok dengan pengocok listrik
selama 15 menit. Bilamana botol berisi penuh dengan air, buka tutup botol
dan buang air sebanayak 20-30 ml, kemudian tutup kembali botol dan kocok.
- Lakukan
pemeriksaan tabung ganda yang terdiri dari :
a. Presumptive
Test ( Uji Pendahuluan atau Uji Perkiraan) : beberapa media yang bisa dipakai
adalah :
-
Lauryl tryptose broth
-
Mac Conkey broth
-
Lactose broth
(paling sering digunakan)
b. Confirmative Test (Uji Penegasan) : digunakan media Brilliant Green Lactose Bile Broth (BGLB)
CARA PEMERIKSAAN:
Ada
2 macam ragam yang digunakan :
Ragam 1 : Untuk spesimen yang sudah diolah atau angka kumannya diperkirakan rendah, digunakan ragam 5 x 10 ml, 1 x 1 ml, 1 x 0,1 ml
Ragam 2 : Untuk spesimen yang belum diolah atau angka kumannya diperkirakan tinggi (misalnya air sumur, air sungai, air mata air dsb), digunakan rama 5 x 10 ml, 5 x 1 ml, 5 x 0,1 ml, muingkin dapat dilanjutkan dengan 5 x 0,01 ml
a. Siapkan :
- 5 tabung yang masing-masing berisi Lactose Broth Double Strength (LBDS) sebanyak 10 ml (tabung 1a – 5a)
- 2 tabung yang masing-masing berisi Lactose Broth Single Strength (LBSS) à tabung 1b dan 2b
b. Dengan pipet steril ke dalam tabung 1a – 5a diinokulasikan
masing-masing 10 ml sampel air
c. Ke dalam tabung 1b diinokulasikan 1 ml sampel air.
d. Ke dalam tabung 2b diinokulasikan 0,1 ml sampel air.
e. Tabung-tabung dikocok perlahan agar sampel air menyebar rata ke
seluruh bagian media.
f. Inkubasi pada suhu 35-37oC selama 24-48 jam
g. Amati masing-masing tabung untuk melihat ada tidaknya gas. Untuk memperjelas terlihatnya gas, kocoklah tabung secara perlahan, bila terlihat gelembung halus maka tabung ini dianggap gas posisitf. Uji Pendahuluan yang positif ditandai dengan terbentuknya gas, tetapi hal ini belum memastikan adanya coliform di dalam air, karena LB dapat juga difermentasi oleh bakteri lain selain coliform, oleh sebab itu Uji Pendahuluan yang positif dilanjutkan dengan Uji Penegasan
Uji Penegasan (Confirmatif Test)
a. Dari tiap-tiap tabung Uji Pendahuluan yang positif, dipindahkan 1-2
ose ke dalam tabung Uji Penegasan yang berisi 10 ml BGLB. Dari masing-masing
tabung Uji Pendahuluan diinokulasikan ke dalam 2 tabung BGLB.
b. Satu seri tabung BGLB diinkubasikan pada suhu 35-37oC
selama 24-48 jam (untuk memastikan adanya coliform), dan satu seri yang lain
diinkubasikan pada suhu 44oC selama
24 jam (untuk memastikan adanya coli tinja).
c. Pembacaan dilakukan setelah 24-48 jam dengan melihat jumlah tabung
BGLB yang menunjukkan positif gas (+g).
- Siapkan
: - 5 tabung yang masing-masing berisi 10 ml LBDS (tabung 1a-5a)
- 5 tabung yang masing-masing berisi 10 ml
LBSS (tabung 1b-5b)
- 5 tabung yang masing-masing berisi 10 ml
LBSS ( tabung 1c-5c)
- Ke
dalam tabung 1a-5a diinokulasikan masing-masing 10 ml sampel air
- Ke
dalam tabung 1b-5b diinokulasikan masing-masing 1 ml sampel air
- Ke
dalam tabung 1c-5c diinokulasikan
masing-masing 0,1 ml sampel air
- Kocok tabung perlahan agar sampel air menyebar rata ke
seluruh bagian media
- Inkubasi
pada suhu 35-37oC selama 24-48 jam
- Amati
masing-masing tabung untuk melihat ada tidaknya gas. Adanya gas
menunjukkan Uji Pendahuluan positif
- Dari
tiap-tiap tabung Uji Pendahuluan positif dipindahkan 1-2 ose ke dalam 2
tabung BGLB
- Satu
seri tabung BGLB diinkubasikan pada suhu 35-37oC selama 24-48
jam (untuk memastikan adanya coliform)
- Satu
seri yang lain diinkubasikan pada suhu 44oC selama 24 jam (untuk memastikan adanya coli
tinja).
- Pembacaan dilakukan setelah 24-48 jam dengan melihat jumlah tabung BGLB yang menunjukkan positif gas (+g).
F. Pembacaan Hasil dan Pelaporan
Catat jumlah tabung Uji Penegasan
(tabung BGLB) yang menunjukkan positif gas. Angka yang diperoleh dicocokkan
dengan table MPN, maka akan diperoleh Indeks MPN coliform untuk tabung yang
diinkubasikan pada suhu 37oC dan Indeks MPN E. coli untuk
tabung yang diinkubasikan pada suhu 44oC.
Untuk Ragam 2 bila penanaman dengan
volume terkecil (0,1 ml) kelima tabung menunjukkan positif gas, maka jumlah
tabung harus ditambah dengan 2 seri kelipatan 1/10 hingga diperoleh jumlah
tabung yang positif gas untuk penanaman pada volume terkecil <5.
Penentuan nilai MPN diambil dari tiga angka terakhir. Tergantung pada berapa kali factor penurunan kelipatan 10 yang digunakan, nilai MPN yang didapat dikalikan factor tersebut.
Contoh Pembacaan :
1.
Untuk Ragam 1
-
Dari penanaman
dengan volume 10 ml diperoleh 4 tabung BGLB positif gas.
-
Dari penanaman
dengan volume 1 ml diperoleh 1 tabung BGLB positif gas.
-
Dari penanaman
dengan volume 0,1 ml diperoleh 0 tabung BGLB positif gas.
Maka nilai MPN/100 ml adalah : 4-1-0 = 21
2.
Untuk Ragam 2
-
Dari penanaman
dengan volume 10 ml diperoleh 5 tabung BGLB positif gas.
-
Dari penanaman
dengan volume 1 ml diperoleh 4
tabung BGLB positif gas
-
Dari penanaman
dengan volume 0,1 ml diperoleh 2 tabung BGLB positif gas.
Maka nilai MPN/100 ml adalah : 5-4-2 = 220
-
Dari penanaman
dengan volume 10 ml diperoleh 5 tabung BGLB positif gas.
-
Dari penanaman
dengan volume 1 ml diperoleh 5
tabung BGLB positif gas.
-
Dari penanaman
dengan volume 0,1 ml diperoleh 5 tabung BGLB positif gas.
Bila dijumpai keadaan demikian di mana nilai
MPN ³
2400, maka jumlah tabung
ditambah dengan seri 5 x 0,01 ml dan 5 x
0,001 ml.
Bila :
-
Dari penanaman
dengan volume 0,01 ml diperoleh 4 tabung BGLB (+g)
-
Dari penanaman
dengan volume 0,001 ml diperoleh 1
tabung BGLB (+g)
Maka angka yang diambil adalah 5-4-1 (5x0,1
ml, 4x0,1 ml, 1x0,001 ml).
Nilai MPN yang diperoleh dari table harus
dikalikan 100 untuk mendapatkan hasil MPN
sebenarnya. Maka nilai MPN/100 ml untuk
sampel ini adalah 170 x 100 = 17.000